生物炭与氮肥配施对植烟土壤微生物及碳氮含量特征的影响

       土壤健康培育和根际微生物调控是实现农业绿色高质量发展重要基础和途径。生物炭作为一种土壤改良剂具有较强的吸附力、极大的比表面积和发达的孔隙结构，在土壤微生态

调控、土壤固碳培肥和缓解温室效应等方面具有良好的效应。土壤微生物是土壤生态的重要组成部分，微生物的数量和新陈代谢的变化都会直接作用于土壤，使土壤养分及结构发生改变 。Prayogo C 等研究发现生物炭能够改变土壤微生物定殖栖息地的理化性质，从而改变土壤微生物的群落结构。同时 Ameloot 等也发现生物炭能够为土壤微生物提供一个舒适的栖息环境，刺激土壤微生物发生改变。 氮肥是植物必需的营养元素之一，是限制作物产质量的重要因子，施用过多或不足均会对土壤及环境造成不良影响。近年来有大量研究表明生物炭能够提升土壤氮素利用率，Wang 等研究发现生物炭增加了土壤中有效氮、磷、钾的含量，改变了土壤物理结构，促进了烤烟根系的健康发展。Oladele 等研究发现生物炭与氮肥配施能够减少硝酸盐的淋失、提高水稻产量和土壤养分有效性。Chaplot 等研究证明山核桃产生的生物炭能够减少土壤中硝酸盐的浸出。因此人们把目光聚集在生物炭与氮肥减施上，以期探究出最有利于土壤健康和可持续性发展的精准施肥模式。沈仁芳等提出土壤研究已经从单一的生产功能研究进入到生产、环境、生态多目标多功能系统的研究阶段。本研究基于土壤健康、土壤微生态环境发展的角度，在邵武烟区深入开展植烟土壤施加生物炭并采取减氮措施试验，从土壤-根系-微生物互作过程对植株养分高效利用的影响入手，以期为我国植烟土壤健康培育和绿色农业发展提供理论依据。 
1  材料与方法 
1.1  试验材料 
       本试验于2018年2月—10月于福建省南平市邵武市沿山镇进行，该烟区为烟稻轮作，植烟土壤均为砂壤土，土壤基本理化性质见表 1。试供烤烟品种为 K326，由福建省南平市邵武市公司提供。试验小区选择有代表性、前茬作物一致、土壤肥力均匀、肥力中等水平的地块。生物炭由河南省生物炭工程技术研究中心提供，原材料为花生壳，在 380~400 ℃条件下低氧、连续炭化 5~6 min 制得，粉碎后过筛（孔径 2.00 mm），其基本理化性质见表 2。

 

1.2  试验方法 
       试验设一个空白对照、一个常规施肥、4 个不同生物炭用量配合不同程度的减氮处理，每个处理3次重复。6个处理具体的施肥配比及小区面积见表 3。空白对照 CK1不施加任何肥料，CK2 按照当地常规施肥模式为：烟草专用肥 525kg/hm² （N：12.5%、P₂O₅：8%、K₂O：22.5%）、芝麻饼肥675kg/hm²（N：5.8%、K₂O：1.3%）、钙镁磷肥 459kg/hm² 、氢氧化镁 187.5kg/hm² 、硝酸钾 345kg/hm²、硫酸钾300kg/hm²，氮磷钾比例为 1∶0.78∶2.87。施肥处理的氮肥基追肥比例为7∶3（70%作为基肥，30%作为追肥），基肥采用条施，追肥于移栽后30天施用。 该试验于2月23日进行烟田整地、施肥及起垄工作，所有物料于起垄前一天条施，施用生物炭后，将其他物料混匀后撒施于生物炭上。烟苗于3月4日进行移栽，采用膜下移栽方式，5月8日开始逐一打顶，烟叶于5月18日开始进行采烤。该试验区烟叶于7月11日全部采收完，7月27日烟叶全部烘烤完毕。 

1.3  土壤养分及碳氮含量分析方法 
       在烟株移栽 45、60、75、90 天时，根据 5 点取样法确定取样点，用铲子将烟株周围10cm 的土壤挖至30cm的深度，切割土壤中烟株的任何侧根，挖出烟株整个根部。将根球放入盆中，摇动根部用铲子从根部去除土壤，采集盆中的土壤放入密封袋中，常温避光条件下风干、磨细、过筛，进行土壤样品分析。测定方法参照文献，有效磷测定采用 0.5 mol/L  NaHCO 3 浸提钼锑抗比色法；速效钾测定采用 0.5  mol/L  NH 4 OAc 浸提-火焰光度法；碱解氮测定采用碱解扩散法；土壤全碳含量测定将称取过 0.149  mm 筛孔的风干土样 20mg，采用  VarioEL III  型元素分析仪测定样品中全碳含量。 
1.4  土壤微生物分析方法 
      在烟株移栽 75 天时，根据 5 点取样法确定取样点，用铲子将烟株周围10cm 的土壤挖至30cm 的深度，切割土壤中烟株的任何侧根，挖出烟株整个根部。将根球放入盆中，摇动根部用铲子从根部去除土壤，取采集盆中无碎块的土壤 5~10 g，除去植物根、动物残骸及其他杂质，混匀过2mm 筛，保存在10mL 无菌离心管中，用干冰保存送往上海美吉生物科技有限公司，对采集的土壤样品进行土壤微生物多样性检测。 
      土壤 DNA 提取和 PCR 扩增：用 E.Z.N.A.®soil 试剂盒（Omega  Bio-tek，Norcross  GAU.S.）提取总 DNA，DNA 的浓度和纯度利用 NanoDrop2000 超微量分光光度计（Thermo Fisher  Scientific 公司）来进行检测，DNA 提取质量利用 1%琼脂糖凝胶电泳来检测；细菌16Sr  RNA 用 338F （ 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' ） 和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物对 V3-V4 可变区进行 PCR 扩增，真菌 18S 用SSU0817F （ 5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3' ） 和 1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）引物对 V5-V7 可变区进行 PCR 扩增 [20] ，扩增的程序为：95 ℃预变性 3 min，27 个循环（95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s），最后 72  ℃延伸 10  min（PCR 仪：ABI  GeneAmp®  9700 型）。扩增体系为 20  μl，4  μl 5*FastPfu 缓冲液，2 μl 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μl 引物（5 Um），0.4 μl FastPfu 聚合酶；10 ng DNA 模板。Illumina  Miseq 测序：PCR 产物用 2%琼脂糖凝胶回收，利用 AxyPrep  DNA  GelExtraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用 QuantiFluor™-ST（Promega，USA）进行检测定量。根据 Illumina MiSeq 平台（Illumina，San Diego，USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建 PE 2×300的文库构建文库步骤：（1）连接“Y”字形接头；（2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）利用 PCR 扩增进行文库模板的富集；（4）氢氧化钠变性，产生单链 DNA 片段利用Illumina 公司的 Miseq PE300 平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。 
1.5  统计方法 
      采用 Microsoft  Excel  2016 分析数据，方差分析采用最小显著性差异（Least  Significant Difference）法用 DPS7.0 软件分析处理数据。微生物使用的 UPARSE 软件，根据 97%的相似度对序列进行 Operational  Taxonomic  Units（OTUs）聚类；使用 UCHIME 软件剔除嵌合体。利用 RDP classifie 对每条序列进行物种分类注释，比对 Silva 数据库（SSU123），设置比对阈值为 70%。韦恩图分析时选用相似水平为 97%的 OTUs 的样本表，利用 R 语言工具统计和作图。可视圈图利用 Circos-0.67-7 软件。Qiime 计算 beta 多样性距离矩阵，R 语言vegan 软件包进行 NMDS 分析和作图。 

3  讨论 
3.1  生物炭与减氮措施配合对土壤养分及碳氮含量的影响 
生物炭本身的养分含量很低，但因其独特的物理特性如较高的比表面积和较大的孔隙度，能够吸附土壤中的氮磷钾元素，减少它们的淋失。由上述结果来看，植烟土壤中施入生物炭会改变土壤的养分情况，添加生物炭后能够提高土壤有效磷、速效钾的含量，Laird等 研究发现生物炭的孔隙结构对肥料养分的延长释放有作用，能够降低养分损失，增加土壤磷钾的有效性，与本文的研究结果相印证。但本试验会出现生物炭施用量大的处理有效磷含量却小的情况，如移栽 90 天时，T3 处理的有效磷含量大于 T4 处理。张阿凤等的研究表明适宜用量的生物炭不仅能够减少土壤有效磷的淋溶和固定，还可以吸附一部分的磷酸根，使得土壤有效磷含量增加幅度较大；但是过高用量生物炭对土壤的影响仅以吸附土壤的磷酸根为主，因此会导致有效磷含量增幅小，与本文的研究结果相印证。本研究中随着生物炭施用量的增加土壤中速效钾的含量也增加，这与前人的研究基本一致。这与生物炭能够提高土壤持水性有关，聂新星等研究发现，土壤水分状况是影响土壤钾素固定和释放的重要因素，生物炭施入土壤后能够通过提高土壤持水能力从而影响土壤钾素。本研究发现生物炭能够增加土壤中的全碳含量及碳氮比，这与前人的研究相似，且发现全碳和碳氮比均随着生物炭用量和减氮比例的增加呈现先增加后减少的趋势，进一步证实生物炭能够保持土壤中的有机质不被降解和淋溶，且因其性质稳定施加到土壤中能够有助于土壤中腐殖质的形成，从而增加碳含量。刘玉学等研究表明，生物炭对 NH₄⁺ 、NO₃^-具有较强的吸附作用，因此土壤中添加生物炭能够减少氮素的淋溶，增加土壤中的氮素含量。值得一提的是对比 CK2 处理来说，生物炭处理能够增加土壤中的碱解氮含量，且存在显著性差异，与梁忠厚等的研究相同。但是较高生物炭施用量及减施氮肥处理（T4）的碱解氮含量却小于T3 处理，主要原因是过量生物炭聚集在在植株根际土壤区域，土壤微生物活性受到抑制，降低土壤氮素的有效性，从而表现土壤氮含量的降低。 
3.2  生物炭与减氮措施配合对土壤微生物的影响 
       土壤微生物是土壤中氮、碳等植物营养元素循环与转化的动力源泉，会通过降解凋落物等腐殖质，将其转化为能够利用吸收的养分，从而帮助土壤保持有效肥力。从土壤微生物的韦恩图和 NMDS 分析图可以看出，生物炭与减氮措施配合对土壤细菌的影响大于土壤真菌的影响。可能与生物炭能够提高土壤的 pH有关，一般有利于细菌繁殖的土壤 pH 高于有利于真菌繁殖的土壤 pH。施用生物炭对土壤微生物的群落结构会产生一定的影响，生物炭与氮肥配施处理较 CK2 处理来说增加了α‐变形菌（Alphaproteobacteria）、纤线杆菌（Ktedonobacteria）、散囊菌纲（Eurotiomycetes）和子囊菌门某纲（norank_p__Ascomycota）的相对丰度，有研究表明生物炭具有独特的结构且含有丰富的营养物质，能够为土壤微生物提供一个更好、更舒适的栖息环境，能够刺激土壤微生物的相对丰度发生改变，有利于某些细菌、真菌的生长，与本文研究结果相印证。本文也发现生物炭与氮肥配施处理较 CK2处理来说放线菌纲（Actinobacteria）及酸杆菌纲（Acidobacteria）的相对丰度会减少，可能是由于本文的生物炭与氮肥配施处理采用了减少氮肥的措施，导致土壤中的氮素较 CK2 来说没有那么的充足而不能很好的支撑某些细菌的生长代谢过程，从而引起某些细菌相对丰度的降低，不过放线菌纲（Actinobacteria）多为致病菌，该菌的减少会降低了土壤病害的发生概率，从而更加有利于土壤健康。 
4  结论 
       生物炭与减氮处理能够在烟草的生长过程中改变植烟土壤的养分情况，适当减氮与生物炭肥的添加能够促进土壤碳氮平衡，改变土壤微生物的群落结构，使土壤向一个更加健康的
环境改变，表明生物炭能够满足我国植烟土壤改良的同时还能实现农业“双减”对烤烟实施肥料减施、有机肥替代部分无机肥的施肥措施提供理论依据。综上所述，以 T3（常规施+氮肥80kg/hm²+生物炭 1350 kg/hm² ）模式对土壤动态养分的影响最符合烤烟不同生育期养分需求，有利于土壤健康土壤培育和植物根际土壤微生物态调控。